Dezaktywacja hipogonadyzmu KISS1 i hipogonadyzmu hipogonadotropowego AD 3

Poziomy LH w surowicy określano za pomocą dwuetapowego testu immunometrycznego typu sandwich i techniki luminometrycznej (Beckman Coulter). Współczynniki zmienności wewnątrz testu i między testami wynoszą odpowiednio mniej niż 6% i mniej niż 7%. Dolna granica wykrywalności z 95% przedziałem ufności wynosi 0,2 mIU na mililitr. Przeprowadziliśmy test stymulacji GnRH w probandzie (Pacjent II-8) przez dożylne wstrzyknięcie 0,1 mg GnRH i pobranie próbek krwi w 0, 20, 40 i 60 minucie po wstrzyknięciu w celu pomiaru FSH i LH. Profilowanie nocnych poziomów LH podczas snu przeprowadzono w fazie środkowo-krzyżowej w probandzie i zdrowej siostrze (pacjent II-6), która miała homozygotyczny genotyp typu dzikiego dla mutacji KISS1 (patrz poniżej). Próbki krwi pobierano co 10 minut przez 4 godziny od północy do 4 rano. Wzór wydzielania LH analizowano zgodnie ze zmodyfikowaną metodą Santena i Bardina.
Genotypowanie
Przeprowadziliśmy automatyczne sekwencjonowanie próbek krwi z probanda dla wariantów w znanych genach lub silnych genach kandydujących na idiopatyczny hipogonadyzm hipogonadotropowy, w tym GNRHR, GNRH1, KISS1R, KISS1, gen sekwencji syndromu Kallmanna (KAL1), gen prokineticin 2 (PROK2) i gen receptora PROK2 (PROK2R) oraz gen receptora genu czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR1). Przeprowadziliśmy analizę genomewidów polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) na mikromacierzach (mikropłytki SNP 250K NspI, Affymetrix) i przeanalizowaliśmy dane za pomocą oprogramowania AutoSNPa.13 Pomaga to zidentyfikować obszary autozygotyczne u dotkniętych osób, które są oparte na dziedziczeniu tego samego mutanta dziedzicznego allel od obojga rodziców.
Wykorzystaliśmy również sekwencjonowanie całego eksonu (selektywne sekwencjonowanie regionów kodujących ludzki genom) w celu zidentyfikowania przyczynowych mutacji. W celu sekwencjonowania egzonu próbki przygotowano jako bibliotekę do sekwencjonowania Illumina, a w drugim etapie biblioteki sekwencjonujące wzbogacono dla pożądanego celu zgodnie z protokołem wzbogacania egzaminu Illumina Exome. Przechwycone biblioteki sekwencjonowano (Illumina HiSeq 2000 Sequencer, Macrogen). Odczyty zostały odwzorowane na UC Santa Cruz Genome Browser (zestaw hg19). Zidentyfikowane mutacje zostały sprawdzone w rodzinnych i sporadycznych przypadkach normogonadotropowego hipogonadyzmu, jak również w dobranych pod względem etnicznym zdrowych dorosłych kontrolnych w naszej kohorcie badania.
Produkcja fosforanu inozytolu
Ludzką kisspeptynę-10 (sekwencja aminokwasowa Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH2) zakupiono od Sigma. Zmutowana ludzka kisspeptyna-10 (sekwencja aminokwasowa Tyr-Asn-Trp-Lys-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH2) została zsyntetyzowana na zamówienie o czystości co najmniej 95% (EZBiolabs). Zmutowana i typu dzikiego kisspeptyna-10 została porównana pod kątem ich zdolności do stymulowania wytwarzania fosforanu inozytolu w komórkach COS-7 transfekowanych KISS1R (patrz Dodatek dodatkowy w celu uzyskania szczegółowych informacji).
Wyniki
Test stymulacji GnRH ujawnił stępioną odpowiedź z maksymalnymi stężeniami LH i FSH wynoszącymi odpowiednio 3,3 i 7,4 miu na mililitr
[podobne: borówka amerykańska sadzonki, naklejka na legitymację, laserowe obkurczanie pochwy ]

Powiązane tematy z artykułem: borówka amerykańska sadzonki laserowe obkurczanie pochwy naklejka na legitymację